Quando comparamos suluções 0 01 mol l de glicose e

FACULDADE DE AMERICANA CURSO DE NUTRIÇÃO BIOQUÍMICA Camila Beckedorff Duarte -RA: 20190764 Daiane Caroline Correia – RA: 20191958 Letícia Libério Batista da Silva – RA: 20191743 Luana Guedes da Silva - RA: 20190791 Mikaelly de Oliveira Piazentin - RA:20191563 Talita Alves Dias Moura- RA: 20190877 Prof. Fábio Domingues Nasário Realização da aula prática dia 25/09/2019 Relatório: Análise da atividade enzimática da amilase salivar - Efeito de pH e temperatura. Americana 2019 INTRODUÇÃO OBJETIVO Tivemos como principal objetivo observar a ação da amilase salivar, enzima segregada pelas glândulas salivares, sobre o amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação. Então fizemos a utilização da amilase salivar, que atua provocando a hidrolise desse polissacarídeo, em diversas temperaturas e concentrações de pH para verificar as diferentes reações que ocorreria. Fizemos todo o processo de preparação da coleta e diluição da enzima, e da caracterização dos padrões que seriam utilizados para comparação e discussão dos resultados obtidos. PARTE EXPERIMENTAL Materiais utilizados no experimento: Tubo de ensaio Tampão fosfato 0,1 mol/L Amido (solução aquosa 1 g%) Glicose (solução aquosa 1 g%) Reativo de Lugol (solução de iodo 0,1 mol/L) NaOH (solução aquosa de hidróxido de sódio 0,1 g%) HCl (solução aquosa de ácido clorídrico 0,1 g%) Pipeta Pasteur Gelo Banho-Maria Saliva Procedimento: Coletamos com o auxílio da pipeta Pasteur 1,5ml de saliva e diluímos em 4,5ml tampão fosfato. Reservamos para a utilização nas etapas posteriores; Utilizamos 2 tubos para caracterizar os padrões. No tubo A inserimos 2,0ml de amido e adicionamos 2 gostas de Lugol, no tubo B inserimos 2,0ml de glicose e também adicionamos 2 gostas de Lugol. Utilizamos para compararmos com os próximos procedimentos; Utilizamos 3 tubos para iniciar o primeiro experimento. O tubo 1C contendo 1,0ml de amido + 2,0ml de tampão fosfato+ 1,0ml da saliva diluída. O tubo 2C contendo 1,0ml de amido + 2,0ml de HCl 0,1 mol/L + 1,0ml da saliva diluída. O tudo 3C contendo 1,0ml de amido + 2,0ml de NaOH 01, mol/L + 1,0ml da saliva diluída. Após as misturas foram inseridos no banho-maria a 37oC por 20 minutos; Enquanto os tubos estavam em banho-maria, demos seguimento ao procedimento, utilizamos mais 3 tubos de ensaio; No tubo 1D foi adicionado 1,0 ml de amido + 2,0ml de tampão fosfato e colocado por 5 minutos a 37°C no banho-maria, retiramos e adicionamos 1,0ml da saliva diluída e foi posto novamente em 37°C por mais 10 minutos; No tubo 2D foi adicionado 1,0ml de amido + 2,0ml de tampão fosfato e colocado no gelo por 5 minutos, retiramos e adicionamos 1,0ml de saliva diluída e foi posto novamente no gelo por mais 10 minutos; No tubo 3D foi adicionado 1,0ml de amido + 2,0ml tampão fosfato e colocado no banho-maria fervente por 5 minutos, retiramos e adicionamos 1,0ml de saliva diluída e foi posto novamente em banho-maria fervente por mais 10 minutos; Após esses procedimentos, observamos as reações, comparamos com os padrões (TUBO A e B), e fizemos as devidas anotações. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os experimentos foram realizados em laboratório, seguindo o roteiro de estudo. Nos foi proposto dois experimentos, no qual o primeiro tinha como principal objetivo a avaliação do efeito do pH na atividade enzimática, e o segundo experimento avaliou o efeito da temperatura na atividade enzimática. A enzima utilizada nos experimentos foi a saliva dos participantes do grupo, e assim pudemos observar que em condições ideias de temperatura (37oC) e pH (6,8) pode ser evidenciada a atividade enzimática de hidrólise do amido pela enzima amilase salivar. Para iniciarmos os experimentos, fizemos a coleta da enzima (saliva): utilizamos um copo plástico, onde inserimos 1,5ml de saliva e diluímos com 4,5ml de tampão fosfato pH 6,8. Reservamos. Também preparamos a caracterização dos padrões, que serviu como base pra análise dos resultados no final de cada experimento. Identificamos dois tubos de ensaio, como A e B: O tubo A continha uma mistura de 2,0ml de amido + 2 gotas de reativo de Lugol, o que resultou em uma cor azul-arroxeada, evidenciando a formação de complexo de iodo com o polissacarídeo amido, sendo caracterizado um padrão indicativo de que não ocorreu hidrólise. Já o tubo B continha uma mistura de 2,0ml de glicose + 2 gotas de reativo de Lugol, o que resultou em uma cor amarelada, sendo caracterizado um padrão de hidrólise total do amido, como mostra a figura a seguir: Figura 1: Tubos de ensaio A e B contendo padrão indicativo Após realizarmos as etapas de preparação da enzima e dos padrões indicativos, demos início ao primeiro experimento avaliação do efeito do pH na atividade enzimática. Utilizamos 3 tubos de ensaio: 1C (1,0ml de amido+ 2,0ml de tampão fosfato pH 6,8+ 1,0ml de saliva diluída), 2C (1,0ml de amido+ 2,0ml de HCl 0,1 mol/L+ 1,0ml de saliva diluída) 3C (1,0ml de amido+ 2,0ml NaOH 01, mol/L+ 1,0ml de saliva diluída) Em seguida inserimos os tubos no banho-maria a 37oC por 20 minutos. Retiramos os tubos de ensaio e adicionamos 2 gotas de reativo de Lugol, homogeneizamos e obtivemos os resultados a seguir: Figura 2: Tubos de ensaio contendo o resultado do primeiro experimento. Observamos os resultados obtidos e comparamos com o padrão indicativo que havíamos preparado anteriormente. E chegamos as seguintes conclusões: Tubo 1C Apresentou coloração transparente. A enzima reagiu, ou seja, ocorreu a hidrólise, pois como vimos e enzima α-amilase presente na saliva, quando se encontra em condições favoráveis de pH e temperatura, catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas do amido. Nesse caso, o pH 6,8 da solução tampão e a temperatura foi favorável para que ocorresse a atividade enzimática. Tubo 2C Apresentou coloração azul-arroxeada. A enzima não reagiu, não ocorrendo a hidrólise, por mais que estivesse em uma temperatura favorável o HCl possui um pH ácido, ou seja, não favorável para que ocorresse a atividade enzimática. Tubo 3C Apresentou coloração transparente. Ocorreu um falso resultado por estar em meio básico. Demos sequência ao segundo experimento efeito da temperatura na atividade enzimática. Utilizamos também 3 tubos de ensaio: 1D (1,0ml de amido+ 2,0ml de tampão fosfato pH 6,8) inserimos o tubo por 5 minutos no banho-maria a 37oC, após esse tempo adicionamos 1,0ml de saliva diluída e em seguida mais 10 minutos de banho-maria a 37oC. 2D (1,0ml de amido+ 2,0ml de tampão fosfato pH 6,8) inserimos o tubo por 5min no gelo, após esse tempo adicionamos 1,0ml de saliva diluída e em seguida mais 10 minutos no gelo. 3D (1,0ml de amido+ 2,0ml de tampão fosfato pH 6,8) inserimos o tubo por 5 minutos em banho-maria fervente, após esse tempo adicionamos 1,0ml de saliva diluída e em seguida mais 10 minutos de banho-maria fervente. Depois de retirado do banho-maria fervente, foi resfriado por 5 minutos no gelo. Após todos os procedimentos, adicionamos 2 gotas de reativo de Lugol, homogeneizamos e obtivemos os resultados a seguir: Figura 3: Tubos de ensaio contendo o resultado do segundo experimento. Observamos os resultados obtidos e comparamos com o padrão indicativo que havíamos preparado anteriormente. E chegamos as seguintes conclusões: Tubo 1D.Apresentou uma coloração levemente azul- arroxeada. Houve uma reação pequena. Acreditamos que se o tubo tivesse passado mais algum tempo em banho-maria a 37oC, a reação teria sido mais eficaz. Tubo 2D Apresentou uma coloração azul-arroxeada forte. Não reagiu, ou seja, não ocorreu a hidrólise do amido, pois esse tubo passou pelo processo do gelo, uma temperatura bem abaixo de 37oC, então conseguimos verificar que a temperatura não foi favorável para ocorrer a atividade enzimática, mesmo estando em pH favorável. Tubo 3D Apresentou uma coloração azul-arroxeada forte. Não reagiu, ou seja, não ocorreu a hidrólise do amido, esse tubo