Funcionam como “cola”, unindo fragmentos de dna para a produção de moléculas recombinadas.

Utilizando complexas e modernas técnicas de laboratório, a Engenharia Genética é capaz de: • isolar um gene e determinar a sequência de seus nucleotídeos; • juntar nucleotídeos e produzir um gene; • alterar a sequência nucleotídica de um gene, produzindo assim um gene mutante; • introduzir no DNA de um vírus ou de uma bactéria um gene extraído de outro organismo. A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Em 1973, o geneticista Stanley Norman Cohen e o bioquímico Herbert Boyer obtiveram o primeiro or- ganismo transgênico, ou organismo geneticamente modificado (OGM): a bactéria Escherichia coli, que recebeu um segmento de DNA da rã africana (Xenopus laevis). Com essa tecnologia do DNA recombi- nante produziram, posteriormente, vírus, bactérias e até plantas e animais transgênicos. A clonagem de DNA significa produzir inúmeras cópias idênticas de um mesmo fragmento da molécula de DNA. Esse processo tem início com o isolamento, pela ação das enzimas de restrição, de fragmentos do DNA a serem clonados. Depois de isolados, esses trechos são introduzidos no DNA de outros orga- nismos, principalmente vírus e bactérias, chamados vetores. Ao se reproduzir, esses microrganismos multiplicam as moléculas recombinantes, dando origem a muitas cópias idênticas. Consegue-se, desse modo, produzir grande número de cópias exatas (clones) de um mesmo trecho do DNA. No experimento do geneticista Stanley Norman Cohen e do bioquímico Herbert Boyer, os pesquisadores inseriram uma pequena porção do material genético da rã em um plasmídeo da bactéria. Os plasmídeos são pequenos DNA’s (em forma de anéis) encontrados no citoplasma das bactérias. Posteriormente, quando esses microrganismos replicam seu DNA, multiplicam junto o novo segmento inserido, adqui- rindo, assim, genes de outra espécie, que passam a se expressar e funcionar normalmente nos descen- dentes da bactéria. Fonte: Biologia – Ensino Médio, Volume 3. 49 Um dos exemplos mais conhecidos dessa tecnologia refere-se ao gene para a produção de insulina humana, introduzido na bactéria Escherichia coli. Assim, culturas de E. coli transgênicas produzem, em laboratório, grandes quantidades de insulina humana, usada no tratamento de diabéticos. No passado, a única forma de obter insulina era extraí-la do pâncreas de animais como bois e porcos. O esquema a seguir dá uma noção de como um gene exógeno (pertencente a outra espécie) é enxerta- do em uma bactéria, como a E. coli, por exemplo. Fonte: Biologia – Ensino Médio, Volume 3. AS FERRAMENTAS DA ENGENHARIA GENÉTICA A- Enzimas As conquistas da engenharia genética somente foram possíveis graças à descoberta de enzimas espe- ciais. As principais enzimas são: • Enzimas de restrição (ou endonucleases): podem cortar o DNA em pontos determinados, fun- cionando como verdadeiras “tesouras químicas” de precisão. Enzimas de restrição diferentes cortam os DNA’s em pontos diferentes. Produzidas pelas bactérias, as enzimas de restrição são usadas para destruir um DNA estranho que penetra na célula trazido, por exemplo, por um bacteriófago. As enzimas de restrição cortam o DNA nos chamados palíndromos. Chamamos palíndromo a uma sequência de bases que tem a mesma leitura nas duas cadeias de DNA, mas em sentidos opostos. Veja o esquema abaixo: Fonte: Biologia – Ensino Médio, Volume 3. 50 É importante salientar que cada enzima de restrição reconhece uma única e mesma sequência de ba- ses (palíndromo) em qualquer tipo de DNA. A tabela seguinte mostra alguns exemplos de enzimas de restrição, das sequências que reconhecem e a bactéria onde a encontraram. ENZIMA BACTÉRIA DE ORIGEM SEQUÊNCIA DE RECONHECIMENTO EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 3’CTTAAG BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 3’CCTAGG TaqI Thermus aquaticus 5’TCGA 3’AGCT Xbal Xanthomonas badrii 5’TCTAGA 3’AGATCT • Ligases: funcionam como “cola”, unindo fragmentos de DNA para a produção de moléculas recombinadas; • DNA polimerase: produz fita complementar de DNA. No esquema a seguir, foi representada a ação de uma enzima de restrição sobre um plasmídeo e sobre um DNA a ser inserido nesse plasmídeo. Fonte: Biologia – Ensino Médio, Volume 3. 51 B- Vetores Para a obtenção de organismos transgênicos frequentemente são usados vetores (caso de certos vírus e bactérias, como a E. coli). Neles, insere-se o DNA exógeno, que poderá, mais tarde, ser incorporado a outro organismo. Como vimos, os plasmídeos de bactérias são vetores muito usados para a duplicação — ou clonagem — de genes que interessam ao ser humano. Dessa forma, são obtidas muitas cópias do gene em questão. Várias empresas de biotecnologia têm verdadeiras “bibliotecas de genes”, ou genetecas, que são cul- turas de vírus (fagos) ou de bactérias recombinadas com genes específicos inseridos em seu geno- ma. Assim, um pesquisador pode adquirir dessas empresas determinado gene para desenvolver suas pesquisas. C- PCR: a reação da polimerase em cadeia Chamada de PCR, da expressão em inglês polymerase chain reaction, a técnica da reação de polimerase em cadeia permite produzir, a partir de uma pequena amostra de determinado DNA, completamente in vitro, um grande número de cópias desse DNA. As amostras podem ser fragmentos mínimos de qual- quer tecido (sangue, ossos ou pele, por exemplo), esperma, pelos e até material fossilizado. Em alguns casos, por exemplo em medicina legal, a quantidade de DNA recolhido pode ser muito pe- quena para ser analisada diretamente. Com essa técnica, no entanto, pode-se obter, em pouco tempo, uma grande quantidade de cópias daquele determinado segmento, o que possibilita sua manipulação. Antes da PCR, para se detectar genes ou VNTRs havia necessidade de grande quantidade de DNA-alvo, o que nem sempre era possível. Essa dificuldade foi resolvida com a introdução da técnica de PCR, que possibilitou a obtenção de quantidades muito grandes de fragmentos específicos do DNA por meio da amplificação em ciclos. A cada ciclo, a quantidade de DNA-alvo é duplicada, de modo que em 10 ciclos obtêm-se 1 024 vezes mais DNA-alvo; em 20 ciclos, cerca de 1 milhão de vezes mais DNA-alvo; e assim por diante, mostrando a natureza exponencial dessa amplificação. Com isso, pequenas amostras contendo poucos fragmen- tos de DNA podem ser estudadas com mais facilidade. IDENTIFICAÇÃO INDIVIDUAL POR MEIO DO DNA Dado que dois indivíduos sempre apresentarão certo número de diferenças em seus DNA’s (exceto no caso de gêmeos idênticos e dos clones), é possível usar a análise de DNA para determinar a identidade de uma pessoa ou de um animal em particular. Essa particularidade no perfil genético, inerente a cada um de nós, mereceu o nome de DNA fingerprint — em inglês “impressão digital de DNA”, por analogia à singularidade das linhas existentes nos dedos das mãos (impressões digitais). Uma importante aplica- ção da técnica de DNA fingerprint é a determinação de paternidade pela comparação dos padrões do DNA da mãe, da criança e de seus prováveis pais. Para isso, colhem-se amostras de sangue dos envol- vidos e delas se obtém o DNA a ser testado. Os cromossomos humanos contêm cerca de 25 mil genes, mas isso representa apenas 2% do genoma humano. O restante é formado por DNA não codificante. Entre as sequências de DNA não codifican- te, destacam-se as utilizadas para determinar o DNA fingerprint. Essas sequências chamam-se VNTRs (do inglês: Variable Number of Tandem Repeats = número variável de repetições em sequência) e são formadas por repetições de unidades compostas de poucos nucleotídeos. Em humanos, o número de nucleotídeos de cada unidade varia de 5 a 100. Cada indivíduo tem um padrão específico de repetições dessas unidades e esse padrão é herdado dos pais, de acordo com os princípios mendelianos. Obtendo amostras de células nucleadas de um indiví- duo, pode-se isolar o DNA nuclear e cortá-lo utilizando enzimas de restrição específicas para se obte- rem as VNTRs. 52 Uma vez quebrado o DNA, isolam-se fragmentos de diferentes tamanhos, que são separados