ENZYMES IMMOBILISEES SUR UN SUPPORT SOLIDE ENZYMES IMMOBILIZED ON A SOLID SUPPORT
DOMAINE TECHNIQUETECHNICAL AREA
La présente invention concerne un procédé de fixation d'une enzyme sur un support solide insoluble dans l'eau. Elle vise également un complexe support-enzyme et un procédé d'utilisation d'un tel complexe.The present invention relates to a method of fixing an enzyme to a solid support which is insoluble in water. It also relates to a support-enzyme complex and to a method of using such a complex.
TECHNIQUE ANTERIEUREPRIOR ART
Depuis plusieurs années, on cherche à "insolubiliser" des enzymes ou d'autres agents tels des anti-corps, des antigènes ou des acides nucléiques de façon à pouvoir purifier, modifier ou isoler certaines substances avec lesquelles ces "catalyseurs" forment des complexes ou bien favorisent une réaction spécifique.For several years, attempts have been made to "insolubilize" enzymes or other agents such as antibodies, antigens or nucleic acids so as to be able to purify, modify or isolate certain substances with which these "catalysts" form complexes or well favor a specific reaction.
Les tentatives visant à obtenir des associations support enzymes insolubles s'expliquent par le fait que des enzymes sont utilisées dans de nombreuses réactions et qu'il est, non seulement intéressant, du point de vue économique, de récupérer une enzyme onéreuse mais que, de plus, les produits issus de la réaction ne soient pas souillés.Attempts to obtain insoluble enzyme support associations are explained by the fact that enzymes are used in many reactions and that it is not only economically advantageous to recover an expensive enzyme but also moreover, the products resulting from the reaction are not soiled.
Le choix des supports et les méthodes de fixation ou d'association des enzymes ont suscité de nombreux travaux : la littérature scientifique est très abondante et décrit plusieurs supports tels la silice, le ve rre , des polymères synthëriques, des polysacchari des et en particulier la cellulose.The choice of supports and the methods of attachment or association of enzymes have given rise to numerous works: the scientific literature is very abundant and describes several supports such as silica, glass, synthetic polymers, polysaccharides and in particular the cellulose.
La plupart des publications concernant la cellulose visent une cellulose très pure, alors qu'en général la cellulose est associée à des hëmi -celluloses et de la lignine.Most publications on cellulose target a very pure cellulose, while in general cellulose is associated with hemi-cellulose and lignin.
Ainsi, N. WELIKY et H. H. WEETHALL ont publié en 1965 (Immunochemistry Pergamon Press Vol. 2 p. 293-322) un article intitulé "The Chemistry and use of cellulose derivatives for the study of biological Systems".Thus, N. WELIKY and H. H. WEETHALL published in 1965 (Immunochemistry Pergamon Press Vol. 2 p. 293-322) an article entitled "The Chemistry and use of cellulose derivatives for the study of biological Systems".
La cellulose a la réactivité d'un polyalcool et peut être soumise à des réactions d'oxydation, d'estérifi cation, d'étherifi cation, d'halogénation etc.Cellulose has the reactivity of a polyalcohol and can be subjected to oxidation, esterification, etherification, halogenation, etc. reactions.
En particulier, les oxycelluloses, sont couplées à des alcools, des aminés ou des protéines en formant des esters ou des amides.In particular, the oxycelluloses are coupled to alcohols, amines or proteins by forming esters or amides.
On comprend d'ailleurs, eu égard à la nature des réactifs employés pour modifier la cellulose, pourquoi l'on a en général cherché à éliminer la lignine - polymère réticulé dont les nombreux groupes réactifs consomment les corps utilisés pour modifier la cellulose ou bien inhibent les réactions envisagées.We also understand, given the nature of the reagents used to modify cellulose, why we have generally sought to eliminate lignin - crosslinked polymer whose numerous reactive groups consume the bodies used to modify cellulose or else inhibit the reactions envisaged.
Toutefois, le brevet américain 3 841 969. (A. N. EMERY et Col.) décrit une méthode de préparation d'enzymes immobilisées par chëlation avec un complexe métallique et des substances comportant des fonctions hydroxyles : cellulose microcri stalline, cellulose di ëthyl aminoé- tylëe, carboxymëthyl cellulose mais aussi sciure de bois, copeaux de bois.However, American patent 3,841,969 (AN EMERY et al.) Describes a method for preparing enzymes immobilized by chelation with a metal complex and substances comprising hydroxyl functions: microcrystalline cellulose, diethyl aminoetyl cellulose, carboxymethyl cellulose but also sawdust, wood chips.
Cependant outre la difficulté d'utilisation industrielle des chlorures métalliques tels le tétrachlorure de titane ou le chlorure d'étain, on sait que les chélates ne sont pas stables dans des gammes étendues de pH.However, in addition to the difficulty of industrial use of metal chlorides such as titanium tetrachloride or tin chloride, it is known that chelates are not stable over wide pH ranges.
D'autre part, le brevet français 2.247.472 (SNPA) décrit une méthode de fixation d'enzymes sur de la cellulose associée à de la lignine, mais indique, ce qui paraît fort étonnant, que la réaction d'association cellulose-enzyme est favorisée par de la lignine présente à raison de 5 à 25 % en poids, et de préférenceOn the other hand, French patent 2,247,472 (SNPA) describes a method of fixing enzymes on cellulose associated with lignin, but indicates, which seems very surprising, that the cellulose-enzyme association reaction is favored by lignin present in an amount of 5 to 25% by weight, and preferably
10 â 20 % .10 to 20%.
Des grains de rafles de céréales dont la dimension varie entre 0,3 et 10 mm sont tout d'abord délignifiés en surface puis après lavage, traités avec du chlorure de thionyle dans la pyridine, enfin mis en contact avec une solution tamponée d'enzyme.Grains of cereal stalks whose size varies between 0.3 and 10 mm are first delignified on the surface then after washing, treated with thionyl chloride in pyridine, finally brought into contact with an enzyme-buffered solution .
11 semble évident que la lignine n'a aucune influence favorable sur la réaction permettant d'immobiliser l'enzyme puisqu'il est indispensable de commencer par une étape de délignification superficielle des grains.It seems obvious that lignin has no favorable influence on the reaction making it possible to immobilize the enzyme since it is essential to start with a step of surface delignification of the grains.
EXPOSE DE L'INVENTIONSTATEMENT OF THE INVENTION
La présente invention concerne un procédé d'obtention de dérivés enzymatiques dans lesquels l'enzyme est fixée par une liaison covalente sur un support insoluble dans l'eau, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :The present invention relates to a process for obtaining enzymatic derivatives in which the enzyme is fixed by a covalent bond on a support insoluble in water, characterized in that it comprises the following stages:
a) lavage à l'eau d'un support contenant essentiellement de la cellulose et de la liqnine.a) washing with water of a support essentially containing cellulose and liqnine.
b) oxydation ménagée de la fraction osidique du support. c) condensation d'une diamine sur les groupes aldé hydiques du support oxydé.b) controlled oxidation of the osidic fraction of the support. c) condensation of a diamine on the hydric alde groups of the oxidized support.
d) stabilisation de la liaison amine-support par réduction.d) stabilization of the amine-support bond by reduction.
e) activation des groupes aminés par un dialdéhyde.e) activation of the amino groups by a dialdehyde.
f) couplage de l'enzyme sur le support activé.f) coupling of the enzyme on the activated support.
D'une façon préférentielle l'oxydant de l'étape b) est la périodate de sodium, la diamine est 1 'ëthylènedia mine, le réducteur le borohydrure ou le cyanoborohy drure de sodium, le dialdéhyde, le gl utaral dëhyde. L'enzyme peut être notamment l'invertase, la lévane saccharase, la lactase ou la dextranesucrase.Preferably, the oxidant of step b) is sodium periodate, the diamine is 1 ethylenededia mine, the reducing agent is borohydride or sodium cyanoborohydride, dialdehyde, gl utaral dehyde. The enzyme can be in particular invertase, levan sucrase, lactase or dextranesucrase.
Bien que tout support contenant de la cellulose et de la lignine soit utilisable, des résultats particulièrement intéressants ont été obtenus avec la fraction la plus lignifiée des rafles de céréales, notamment des rafles de maïs.Although any support containing cellulose and lignin is usable, particularly interesting results have been obtained with the most lignified fraction of cereal stalks, in particular corn stalks.
Les rafles de ma Ï sont constituées :The roundups of my Ï are made up:
1) d'éléments tendres appelés "Feeds", contenant en majeure partie de la cellulose et des protéines, destinés à l'alimentation du bétail.1) tender elements called "Feeds", containing mainly cellulose and proteins, intended for animal feed.
2) d'éléments durs - appelés GRITS - contenant une grande proportion de lignine (supérieure à 25 % ) , de la cellulose et des xylanes. Ces éléments sont en général broyés et utilisés en raison de leur dureté comme charges ou comme abrasifs. Les particules pseudo-sphériques obtenues ont des dimensions pouvant varier entre quelques dizaines de microns et quelques millimètres.2) hard elements - called GRITS - containing a large proportion of lignin (greater than 25%), cellulose and xylans. These elements are generally ground and used because of their hardness as fillers or as abrasives. The pseudo-spherical particles obtained have dimensions which can vary between a few tens of microns and a few millimeters.
L'invention vise également un dérivé enzymatique dans lequel l'enzyme est liée de façon covalente au support, caractérisé en ce que le support est constitué par la partie des rafles de céréales dont la teneur en lignine est supérieure à 25 %,l'enzyme étant l'invertase, la lëvane saccharase, la lactase ou la dextrane.The invention also relates to an enzymatic derivative in which the enzyme is covalently linked to the support, characterized in that the support consists of the part of the cereal stalks whose lignin content is greater than 25%, the enzyme being invertase, levan sucrase, lactase or dextran.
Un autre objet de l'invention, concerne un procédé de traitement de jus sucrés à l'aide d'enzymes fixées sur la partie des rafles de maïs dont la teneur en lignine est supérieure à 25 % .Another subject of the invention relates to a process for treating sweet juices using enzymes fixed on the part of the corn cobs whose lignin content is greater than 25%.
En particulier, un jus concentré de saccharose est traité par passage sur un lit de particules de rafles de maïs servant de support à l'invertase, en vue de l'obtention d'un sirop inverti.In particular, a concentrated sucrose juice is treated by passing over a bed of corn cob particles serving as support for the invertase, with a view to obtaining an inverted syrup.
Selon une autre forme de l'invention, un jus de saccharose est traité par passage sur un lit de particules de rafles de maïs servant de support à la lëvane saccharase : on obtient un jus contenant du polyfructose et du glucose.According to another form of the invention, a sucrose juice is treated by passing over a bed of corn cob particles serving as a support for the levansucrase: a juice containing polyfructose and glucose is obtained.
Les exemples, ci-après, permettront de mieux comprendre 1 ' invention :The examples below will allow a better understanding of the invention:
L'invertase est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de saccharose en glucose et fructose, dont on a, selon l'invention, réalisé la fixation sur des supports solides insolubles dans l'eau, supports contenant à la fois de la cellulose et de la lignine.Invertase is an enzyme which catalyzes the hydrolysis of sucrose into glucose and fructose, which, according to the invention, has been fixed on supports water insoluble solids, carriers containing both cellulose and lignin.
Plus particulièrement on a étudié la fixation de l'invertase sur la partie "dure" des rafles de maTs dont la teneur en lignine est supérieure à 25 % . Cette partie, "dure" a été broyée de façon à obtenir des particules dont les diamètres sont compris entre 170 microns et 280 microns. Leur densité apparente est de 0,4 Kg .1 à l'état sec et de 1,8 Kq .1 -1 à l'état mouillé. Leur surface spécifique est de 1 m2.g-1. More particularly, the fixation of the invertase on the "hard" part of the maT roundups has been studied, the lignin content of which is greater than 25%. This "hard" part was ground so as to obtain particles whose diameters are between 170 microns and 280 microns. Their apparent density is 0.4 Kg .1 in the dry state and 1.8 Kq .1 -1 in the wet state. Their specific surface is 1 m 2 .g -1.
L'activité de la préparation enzymatique est déterminée en mettant en contact, pendant 4 minutes à 40°C, 10 ml de solution de saccharose 0,4 M dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,5 avec 0,1 ml de solution d'inver tase, (ou de suspension d'invertase immobilisée) dans le même tampon.The activity of the enzyme preparation is determined by contacting, for 4 minutes at 40 ° C., 10 ml of 0.4 M sucrose solution in 0.1 M acetate buffer, pH 4.5 with 0.1 ml. invertase solution (or immobilized invertase suspension) in the same buffer.
La réaction est arrêté en ajoutant 5 ml du milieu à 0,5 ml de solution de soude 2N. La teneur en sucres réducteurs libérés est ensuite déterminée par la méthode du dini trosalicylate (lecture de l'absorbance à mn). Un étalonnage est effectué à l'aide de solutions équi- moléculai res de glucose et de fructose dans le tampon acétate 0,1 M (pH 4,5).The reaction is stopped by adding 5 ml of the medium to 0.5 ml of 2N sodium hydroxide solution. The content of released reducing sugars is then determined by the dini trosalicylate method (reading of the absorbance at min). A calibration is carried out using equimolecular solutions of glucose and fructose in 0.1 M acetate buffer (pH 4.5).
Une unité d'activité enzymatique (U) est définie comme étant la quantité d'enzyme qui provoque la libération de 1 g. de sucres réducteurs par minute dans les conditions d'essai.One unit of enzyme activity (U) is defined as the amount of enzyme that causes the release of 1 g. reducing sugars per minute under the test conditions.
L'activité spécifique de la préparation d'invertase (SIGMA Chem. Co est de 93,3 U/mg d'enzyme. Le procédé de traitement des particules de rafles de maïs comporte les étapes suivantes :The specific activity of the invertase preparation (SIGMA Chem. Co is 93.3 U / mg of enzyme. The process for treating corn cob particles comprises the following steps:
a) lavage préalable à l'eau distillée pendanta) preliminary washing with distilled water for
24 heures à 25°C pour éliminer les substances solubles, suivi par un séchage à 60°C.24 hours at 25 ° C to remove soluble substances, followed by drying at 60 ° C.
b) oxydation ménagée par mise en contact d'un échantillon de 100 mg avec 20 ml de solution de mëtopériodate de sodium dans l'eau distillée à 25°C, dans l'obscurité.b) controlled oxidation by bringing a 100 mg sample into contact with 20 ml of sodium metoperiodate solution in distilled water at 25 ° C in the dark.
c) amination par réaction des rafles oxydées avec 20 ml de solution de diamine dans le méthanol à 25°C.c) amination by reaction of the oxidized stems with 20 ml of diamine solution in methanol at 25 ° C.
On a pour cette étape, testé les diamines suivantes :For this step, we tested the following diamines:
- 1 ' éthyl ênedi ami ne- 1 ethyl ethyl friend
- 1 ' hexamëthyl ênedi ami ne- 1 hexamethyl friend no
- 1 ' octamëthyl ènedi ami ne- 1 octamëthyl ènedi ami ne
- le diamino dicyclohexyl mëthade- the diamino dicyclohexyl methade
- le diamino diphényl méthane.- diamino diphenyl methane.
d) réduction par mise en contact à 25°C soit avecd) reduction by contacting at 25 ° C., either with
25 ml de solution de borohydrure de sodium, dans du tampon carbonate 0,05 M, pH 10,5, ou dans du méthanol, soit par 20 ml de solution de cyanoborohydrure de sodium, dans du tampon phosphate 0,05 M, pH 6,5.25 ml of sodium borohydride solution, in 0.05 M carbonate buffer, pH 10.5, or in methanol, or by 20 ml of sodium cyanoborohydride solution, in 0.05 M phosphate buffer, pH 6 , 5.
e) activation par une solution de glutaraldëhyde dans du tampon pyrophosphate 0,05 M, pH 8,6 à 25°C. f) fixation de l'invertase en solution dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,5, à 4°C.e) activation with a solution of glutaraldehyde in 0.05 M pyrophosphate buffer, pH 8.6 at 25 ° C. f) fixation of the invertase in solution in 0.1 M acetate buffer, pH 4.5, at 4 ° C.
Chaque étape est suivie de deux lavages des rafles par remise en suspension pendant 15 mn, dans 20 ml du milieu utilisé au cours de l'étape précédente - ne contenant pas l'espèce réactive - puis par trois lavages par remise en suspension dans le milieu utilisé au cours de 1 ' étape suivante.Each step is followed by two washes of the stalks by resuspension for 15 min, in 20 ml of the medium used during the previous step - not containing the reactive species - then by three washes by resuspension in the medium used in the next step.
Les diverses étapes peuvent être schématisées, dans leur principe, de la façon suivante :The various stages can be schematized, in principle, as follows:
oxydationoxidation
Activation
Immobi 1 i sation
• _ -iim-mi-m'i' r Après greffage de l'enzyme, le support est lavé par 20 ml de so lution de NaCl 1M dans l'eau distillée afin d'éliminer l'inver¬ tase simplement adsorbée. On procède ensuite à la détermination de l'activité retenue sur l'échantillon de rafles. • _ -iim-mi-m'i ' r After grafting of the enzyme, the support is washed with 20 ml of 1M NaCl so lution in distilled water to remove the inver ¬ tase simply adsorbed. We then proceed to determine the activity retained on the sample of roundups.
On a bien évidemment cherché à optimiser les différentes étapes :We obviously tried to optimize the different stages:
1) Oxydation1) Oxidation
a) influence de la concentration du përiodate de sodiuma) influence of the concentration of sodium periodate
Les conditions expérimentales choisies sont les suivantes :The experimental conditions chosen are as follows:
TABLEAU N° 1TABLE N ° 1
On a pu, en faisant varier la concentration en NaIO 4 , obtenir les resul tats présentés dans le tableau Nº 2. It was possible, by varying the concentration of NaIO 4 , to obtain the results presented in Table No. 2.
TABLEAU N'TABLE N '
En effectuant la réduction par du cyanoborohydrure de sodium (concentration 10g1-1, tampon phosphate pH 6,5, durée 2 heures) â la place du borohydrure de sodium, toutes autres conditions égales par ailleurs, on obtient les résultats présentés dans le tableau 3 :By carrying out the reduction with sodium cyanoborohydride (concentration 10g1 -1 , phosphate buffer pH 6.5, duration 2 hours) in place of sodium borohydride, all other conditions being equal, the results presented in Table 3 are obtained. :
TABLEAU N° 3TABLE N ° 3
On constate donc que, quelle que soit la méthode de réduction utilisée, le greffage optimal de l'enzyme est obtenu au delà d'une concentration de mëtapêriodate de sodium 0,2 M.It can therefore be seen that, whatever the reduction method used, the optimal grafting of the enzyme is obtained above a concentration of 0.2 M sodium metapriodate.
b) influence de la duréeb) influence of duration
La concentration en métapériodate étant fixée à 0,2 M et toutes les autres conditions expérimentales étant identiques à celles choisies en a) (mis à part le milieu réducteur mëthanolique remplacé par un tampon phosphate) on obtient les résultats présentés dans le tableau 4 :
TABLEAU N° 4TABLE N ° 4
Le temps optimal d'oxydation retenu est de 30 heures.The optimal oxidation time used is 30 hours.
Il est à remarquer que l'oxydation paraît procéder .en deux étapes :It should be noted that the oxidation appears to proceed in two stages:
- une première étape rapide (0 - 2h)- a quick first step (0 - 2h)
- une seconde étape plus lente (2 - 24h).- a second, slower stage (2 - 24h).
2) Oxydation2) Oxidation
a) influence de la nature de la diaminea) influence of the nature of the diamine
La durée d'oxydation par du périodate de sodium 0,2 M étant fixée à 30 heures, les autres conditions expërimen taies étant celles choisies en 1 a) on obtient les résultats présentés dans le tableau 5 :The oxidation time with 0.2 M sodium periodate being fixed at 30 hours, the other experimental conditions being those chosen in 1 a) the results presented in Table 5 are obtained:
TABLEAU N° 5TABLE N ° 5
Les activités enzymatiques les plus élevées sont donc obtenues lorsqu'on utilise 1'éthyl ënediami ne (C2H8N2). b) influence de la concentration de 1 ' ëthyl ênedi ami neThe highest enzymatic activities are therefore obtained when ethylene Miami (C 2 H 8 N 2 ) is used. b) influence of the concentration of ethyl friend
Les conditions expérimentales étant celles de l'exemple 1) a) (mis à part la durée de l'oxydation ramenée à 13 h. et le milieu réducteur méthanolique remplacé par un tampon de carbonate) on obtient les résultats présentés dans le tableau 6 :The experimental conditions being those of Example 1) a) (apart from the duration of the oxidation reduced to 13 h. And the methanolic reducing medium replaced by a carbonate buffer) the results presented in Table 6 are obtained:
TABLEAU Nº 6TABLE Nº 6
On notera qu'une activité catalytique importante est obtenue avec une concentration relativement faible de diamine (0,05 M) On considère cependant que la concentration optimale est 3 M.It will be noted that a significant catalytic activity is obtained with a relatively low concentration of diamine (0.05 M) It is however considered that the optimal concentration is 3 M.
c) influence de la duréec) influence of duration
Les conditions expérimentales sont les suivantes : The experimental conditions are as follows:
TABLEAU Nº 7TABLE Nº 7
Les résultats sont donnés dans le Tableau N° 8 :The results are given in Table No. 8:
TABLEAU N° 8TABLE N ° 8
Une durée de 72 heures a donc été retenue pour l'étape d'amination.A duration of 72 hours was therefore chosen for the amination stage.
3) Réduction a) influence de la nature et de la concentration de l'agent de réduction. Le conditions exrerimentales sont les suivantes : 3) Reduction a) influence of the nature and concentration of the reducing agent. The test conditions are as follows:
TABLEAU N ° 9TABLE N ° 9
Les résultats sont donnés dans le tableau 10 :The results are given in Table 10:
TABLEAU N° 10TABLE 10
Le cyanoborohydrure s'avère donc être l'agent de réduction le plus efficace. b) influence de la durée de réactionCyanoborohydride therefore proves to be the most effective reducing agent. b) influence of the reaction time
Les conditions expérimentales sont les suivantes :The experimental conditions are as follows:
TABLEAU N° 11TABLE N ° 11
Les résultats sont donnés dans le tableau 12 :The results are given in table 12:
TABLEAU N° 12TABLE N ° 12
4) Activation4) Activation
a) influence de la concentration du gl utaral déhyde et de la duréea) influence of the concentration of glutar dehyde and the duration
Les conditions expérimentales sont identiques à celles de 1 'essai 3 b) . Les résultats, exprimés en U/g de rafles, sont donnés dans le tableau N° 13.The experimental conditions are identical to those of test 3 b). The results, expressed in U / g of roundups, are given in Table No. 13.
TABLEAU N° 13TABLE N ° 13
La concentration optimale est donc de 1,25 % et la durée de 5 heures.The optimal concentration is therefore 1.25% and the duration of 5 hours.
5) Fixation de l'invertase5) Fixing the invertase
a) influence de la concentration de l'invertase et de la durée de fixationa) influence of the invertase concentration and the duration of fixation
Les conditions expérimentales sont identiques à celles de 1 'essai 3 b).The experimental conditions are identical to those of test 3 b).
Les résultats sont donnés dans le tableau 14. The results are given in Table 14.
TABLEAU N° 14TABLE N ° 14
La concentration optimale de l'invertase est donc de 2g 1 -1 et la durée optimale de fixation est de 30 heures.The optimal concentration of invertase is therefore 2g 1 -1 and the optimal duration of fixation is 30 hours.
Le tableau 15 regroupe les conditions optimales de fixation de l'invertase sur les rafles de maïs.Table 15 lists the optimal conditions for attaching invertase to corn cobs.
TABLEAU N° 15TABLE N ° 15
On a testé d'autres méthodes d ' immobilisation de l'invertase sur les rafles de maïs : - ab s o rp ti onWe tested other methods of immobilizing invertase on corn cobs: - ab so rp ti on
- absorption suivie d'une rëticulation par le glutaral déhyde- absorption followed by cross-linking by glutaral dehyde
- fixation directe sur les rafles oxydées- direct attachment to oxidized stems
- greffage des diamines aromatiques activées par diazotation.- grafting of aromatic diamines activated by diazotization.
- oxydation des aldéhydes en aci des, suivie d'une activation selon la méthode à l'azoture.- oxidation of aldehydes to acids, followed by activation according to the azide method.
Aucune de ces méthodes n'a donné de résultats comparables à ceux obtenus par le procédé selon l'invention.None of these methods gave results comparable to those obtained by the process according to the invention.
On a en particulier mis en application la méthode décrite dans le brevet français 2 247 472 ; Deux supports ont été utilisés :In particular, the method described in French patent 2 247 472 has been applied; Two supports were used:
1) échantillon de rafles entières, broyées mécaniquement et tamisées afin de ne conserver que la fraction de diamètre de particules compris entre 100 et 200 microns.1) sample of whole cobs, mechanically crushed and sieved in order to keep only the fraction of particle diameter between 100 and 200 microns.
2) échantillon de "GRITS" d'un diamètre compris entre 170 et 280 microns.2) "GRITS" sample with a diameter between 170 and 280 microns.
L'immobilisation de l'invertase a été réalisée par mise en contact de 100 mg de support activé avec 20 ml de solution d'invertase (SIGMA Chem. Co I 5875) à 2gl_ 1 dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,5, pendant 30 heures sous agitation rotative à 4°C.The immobilization of the invertase was carried out by bringing 100 mg of activated support into contact with 20 ml of invertase solution (SIGMA Chem. Co I 5875) at 2gl _ 1 in 0.1 M acetate buffer, pH 4.5, for 30 hours with rotary stirring at 4 ° C.
Après élimination exhaustive de l'enzyme non fixée, par lavaπe des supports à l'aide de tampon acétate 0,1 M, pH 4,5, l'activité retenue a été déterminée en mesurant la quantité de sucres réducteurs (glucose et fructose) libérés par action de l'enzyme sur une solution de saccharose 0,4 M à 40°C.After exhaustive elimination of the unfixed enzyme, by washing the supports using 0.1 M acetate buffer, pH 4.5, the activity retained was determined by measuring the quantity of reducing sugars (glucose and fructose) released by the action of the enzyme on a 0.4 M sucrose solution at 40 ° C.
Les résultats sont donnés dans le tableau N° 16 : The results are given in table No. 16:
TABLEAU N° 16TABLE N ° 16
Les activités enzymatiques obtenues avec des supports traités selon l'invention sont de 40 à 80 fois supérieures à celles obtenues avec les mêmes supports traités selon le brevet français 2 247 472.The enzymatic activities obtained with supports treated according to the invention are 40 to 80 times greater than those obtained with the same supports treated according to French patent 2 247 472.
On a testé également les possibilités d'utilisation en continu de l'invertase immobilisée sur rafles de maTs, dans un réacteur à lit fixe de 10 ml de volume, garni de 1,9 g de rafles portant l'enzyme. Ce réacteur, placé dans une enceinte thermostatëe à 40°C, est alimenté en continu à l'aide de solutions de saccharose de concentration variable dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,5.We also tested the possibilities of continuous use of the invertase immobilized on maTs roundups, in a fixed bed reactor of 10 ml volume, packed with 1.9 g of roundups carrying the enzyme. This reactor, placed in an enclosure thermostated at 40 ° C., is continuously supplied with the aid of sucrose solutions of variable concentration in 0.1 M acetate buffer, pH 4.5.
Les résultats sont donnés dans le tableau N° 17 . The results are given in table No. 17.
TABLEAU N° 17TABLE N ° 17
On atteint donc des productivités horaires maximales qui sont :We therefore reach maximum hourly productivities which are:
- pour une concentration initiale de saccharose 0,1 M : 22 g de saccharose hydrolyse par heure et par g de rafles.- for an initial concentration of 0.1 M sucrose: 22 g of sucrose hydrolyzed per hour and per g of stems.
- pour une concentration initiale de saccharose 1 M : 117 g de saccharose hydrolyse par heure et par g de rafles.- for an initial concentration of 1 M sucrose: 117 g of hydrolyzed sucrose per hour and per g of stems.
En vue d'étudier la transposition à l'échelle industrielle du procédé d'hydrolyse en continu de jus de saccharose, on a réalisé les expériences suivantes :In order to study the transposition on an industrial scale of the process of continuous hydrolysis of sucrose juice, the following experiments were carried out:
Deux réacteurs ont été utilisés :Two reactors were used:
- réacteur A : Volume total 100 ml. quantité de rafles : 44,1 g- reactor A: Total volume 100 ml. quantity of stems: 44.1 g
- réacteur B : Volume total 1 litre quantité de rafles : environ 400 g.- reactor B: Total volume 1 liter quantity of roundups: approximately 400 g.
Une préparation commerciale d'invertase (SIGMA Chem. Co.) a été immobilisée sur des rafles de mais dont le diamètre moyen était de 0,81 mm. Les résultats obtenus pour les 2 réacteurs successivement préparés sont regroupés dans le tableau N° 18 : A commercial preparation of invertase (SIGMA Chem. Co.) was immobilized on corn cobs, the average diameter of which was 0.81 mm. The results obtained for the 2 reactors successively prepared are collated in Table No. 18:
TABLEAU N° 18TABLE N ° 18
(a) : l'activité est exprimée en g de sucres réducteurs libérés par mm et par g de support dans les conditions d'essai.(a): the activity is expressed in g of reducing sugars released per mm and per g of support under the test conditions.
(b) : le rendement de l'immobilisation est exprimé comme le rapport de l'activité par mg d'enzyme immobilisée à l'activité par mg d'enzyme libre.(b): the yield of the immobilization is expressed as the ratio of the activity per mg of immobilized enzyme to the activity per mg of free enzyme.
(c) : les conditions optimales d'immobilisation ont été déterminées précédemment, au niveau d'échantillons de 100 mg de rafles.(c): the optimal immobilization conditions were determined previously, at the level of samples of 100 mg of roundups.
On notera que le problème de l'extrapolation de l'immobilisation de l'invertase de l'échelle d'échantillons de supports de 100 mg à l'échelle de quantité de rafles allant jusqu'à 1 kg. a été résolu puisque les résultats obtenus pour le réacteur B sont voisins de ceux obtenus dans les conditions optimales.It will be noted that the problem of extrapolating the immobilization of invertase from the scale of support samples from 100 mg to the scale of quantity of roundups up to 1 kg. has been resolved since the results obtained for reactor B are close to those obtained under optimal conditions.
Le tableau N° 19 regroupe les résultats concernant la production de glucose et fructose (exprimés en g de sucres réducteurs produit par heure et par g de rafles).Table No. 19 groups together the results concerning the production of glucose and fructose (expressed in g of reducing sugars produced per hour and per g of stalks).
La productivité maximale a été déterminée respectivement pour un taux de conversion de 90 % et de 100 % de saccharose initial. Maximum productivity was determined respectively for a conversion rate of 90% and 100% of initial sucrose.
TABLEAU N° 19TABLE N ° 19
L'extrapolation des résultats du réacteur de 100 ml à celui de 1 litre est sensiblement linéaire, les productivités maximales étant dans le même rapport que les activités enzymatiques par g de support (0,32 U et 0,84 U respectivement).The extrapolation of the results from the 100 ml reactor to that of 1 liter is substantially linear, the maximum productivities being in the same ratio as the enzymatic activities per g of support (0.32 U and 0.84 U respectively).
L'invertase immobilisée s'avère extrêmement efficace puisque à partir des résultats obtenus avec le réacteur de 1 litre pour une solution à 68,4 % de saccharose, on obtient, à 50°C, une productivité de 11 g de sucres réducteurs par jour pour le réac teur de 1 litre de volume (le taux de conversion étant de 90 %)Immobilized invertase is extremely effective since from the results obtained with the 1 liter reactor for a 68.4% sucrose solution, a productivity of 11 g of reducing sugars per day is obtained at 50 ° C. for the 1 liter volume reactor (the conversion rate being 90%)
La stabilité du catalyseur est très bonne car aucune diminution notable d'activité n'a pu être notée après 20 jours de fonction nement continu (avec séjour à 40°C, 50°C, 55°C, et 60°C) pour le réacteur de 1 litre.The stability of the catalyst is very good because no significant decrease in activity could be noted after 20 days of continuous operation (with stay at 40 ° C, 50 ° C, 55 ° C, and 60 ° C) for the 1 liter reactor.
Le traitement d'un sirop de refonte de sucre pur ou de sirop industriel provenant de la betterave ou de la canne à sucre, titrant environ 70 Brix à une température comprise entre 40 et 60°C, s'est avéré positif.The processing of a pure sugar redesign syrup or industrial syrup from beet or cane, grading about 70 Brix at a temperature between 40 and 60 ° C, has been positive.
Toutefois la Droductivitë maximale est alors 2 fois plus faible que pour une solution à environ 70 % de saccharose.However, the maximum Dructivity is then 2 times lower than for a solution with approximately 70% of sucrose.
Il est néanmoins possible d'envisager l'hydrolyse continue de solutions aussi concentrées de saccharose, moyennant un pré chauffage du sirop destiné à en abaisser la viscosité.It is nevertheless possible to envisage the continuous hydrolysis of such concentrated solutions of sucrose, by means of a preheating of the syrup intended to lower the viscosity.
Il est important de souligner que les dérivés enzymatiques obtenus selon l'invention permettent de traiter en continu des jus très concentrés de saccharose sans pour autant voir leur activité diminuer.It is important to emphasize that the enzymatic derivatives obtained according to the invention make it possible to continuously process highly concentrated sucrose juices without seeing their activity decrease.
On comprend aisément l'avantage considérable que l'on en tire sur le plan industriel ; volume réduit des installations, économies d'énergie, durée de vie du support enzymatique. It is easy to understand the considerable advantage that is drawn from this on the industrial level; reduced volume of installations, energy savings, lifespan of the enzymatic support.