O que é microarray de hibridizacao genomica comparativa

A técnica de hibridização genômica comparativa por microarranjo (array-CGH) tem impulsionado a Citogenética
Molecular, uma vez que algumas condições genéticas podem ser causadas por mutações cromossômicas
submicroscópicas, que não são detectáveis pelas técnicas convencionais de Citogenética, por exemplo, o cariótipo.

Nessas situações, a metodologia recomendada para investigação do diagnóstico é o array-CGH, sendo
considerada padrão ouro na busca por deleções e duplicações de material genético, com uma resolução 1.000x
maior que a de um cariótipo.

O array-CGH é uma ferramenta de diagnóstico genético importante, com maior densidade de sondas em regiões
clinicamente relevantes, possibilitando a detecção de alterações que afetam total ou parcialmente um único gene.
Esse exame é recomendado em casos de:

• Deficiência intelectual e atraso de desenvolvimento neuropsicomotor;
• Síndromes genéticas não reconhecíveis clinicamente;
• Cariótipo normal ou inconclusivo;
• Cariótipo com cromossomo marcador ou translocações;
• Análise de material de abortos;
• Genitália ambígua;
• Transtorno do espectro autista (TEA) e Epilepsia;
• Malformações congênitas, entre outras indicações.

É importante ressaltar que nem toda deleção ou duplicação leva necessariamente a uma condição genética. Estudos populacionais
mostraram que existem variações no número de cópias (CNVs) de segmentos de DNA que são relativamente frequentes na população
geral, constituindo polimorfismos. Um desses estudos, por exemplo, mostrou que, em média, cada indivíduo é portador de
aproximadamente 104 variações genéticas comuns presentes em pelo menos 3% da população. Cerca de 70% dessas variantes
incluem genes relacionados aos sentidos (olfato, audição, visão e paladar) e à suscetibilidade a doenças complexas, como câncer,
diabetes, esquizofrenia e Alzheimer.

Portanto, para análise e interpretação do exame de array-CGH, as alterações encontradas são pesquisadas em literatura científica, em
bases de dados especializados, assim como avaliadas quanto ao tipo (deleção ou duplicação), tamanho, genes afetados e
mecanismo etiológico da hipótese diagnóstica, visando à correta identificação de alterações patogênicas ou possivelmente
patogênicas, de acordo com as diretrizes do ACMG (American College of Medical Genetics) e pertinentes com o fenótipo do paciente.
Alguns resultados podem ser não informativos, resultando em variantes de significado incerto (VUS), sem evidências científicas
satisfatórias. Geralmente trata-se de variantes raras, ausentes ou em baixa frequência nos bancos de dados populacionais, sem relatos
anteriores e preditas como modificadoras da função proteica por programas computacionais (in silico).

O array-CGH baseia na comparação entre a emissão de sinal decorrente da hibridização de DNA teste (amostra) e DNA referência
(controle), submetidos a todo procedimento técnico simultaneamente, porém marcados com diferentes fluoróforos, em sondas
(sequências genômicas de referência) fixadas em uma plataforma (lâmina).

Existem múltiplas tecnologias de a-CGH no mercado, que diferem quanto à capacidade das plataformas, por exemplo: cobertura do
genoma, ou seja, intervalo de análise entre as sondas, cobertura dos genes disponíveis no OMIM e ClinGen, número de sondas para
CNVs e SNPs, detecção de região de LOH (loss of heterozygositye – perda de heterozigosidade) e dissomia uniparental.
As opções disponíveis pelo DB Molecular constam no quadro abaixo. Para mais informações, acesse nosso Guia de exames.

*Solicitar o kit coletor específico no e-mail:

Referências
1. MANNING, M. Array-based technology and recommedations for utilization in medical genetics practice for detecction of chromosomal
abnormalities. Genetics in Medicine: American College of Medical Genetics and Genomics. nov. 2010, v. 12, n. 11. p. 742-745.
2. SCHAEFER, B. D. et al. Clinical genetics evaluation in identifying the etiology of autism spectrum disorders: 2013 guideline revisions. Genetics
in Medicine American College of Medical Genetics and Genomics. mar. 2013, v. 15, p. 399-407.
3. SOUTH, S. T. et al. ACMG Standards and guidelines for constitutional cytogenomic microarray analysis, including postnatal and prenatal
applications: revision 2013. Genetics in Medicine: American College of Medical Genetics and Genomics. nov. 2013, v. 15, n. 11, p. 901-909.

Anormalidades no número de cópias do DNA são freqüentemente encontradas em pacientes com múltiplas síndromes de anomalia e retardo mental. A hibridização genômica comparativa baseada em matriz (array-CGH) é uma tecnologia de alta resolução e genoma completo que melhora a detecção de aberrações submicroscópicas subjacentes a essas síndromes. Oito pacientes com deficiência mental, anomalias congênitas múltiplas e características dismórficas foram selecionados para desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos usando o GenoSensor Array 300 Chip. As aberrações subteloméricas previamente detectadas pela análise de hibridização fluorescente in situ (FISH) foram confirmadas em dois pacientes, e o diagnóstico preciso foi fornecido em dois casos complexos não diagnosticados anteriormente. Microdeleções em 15q11.2-q13 em um recém-nascido com hipotonia, criptorquidia e hipopigmentação foram detectadas com poucas discrepâncias entre os resultados da matriz e a análise de FISH. A microdeleção contígua dos genes GSCL, HIRA e TBX1 em 22q11.2 foi identificada em um menino previamente não diagnosticado com uma apresentação incomum do espectro VCF / DiGeorge. Em um recém-nascido com aniridia, uma deleção de WT1 falso-negativo limítrofe foi observada, provavelmente devido a diferenças entre o tamanho da deleção genômica e a sonda de microarray. Uma taxa de falso-positivo de 0, 2% foi calculada para análise de clone por clone, enquanto a taxa de falso-positivo por paciente foi de 20%. O Array-CGH é uma ferramenta poderosa para a detecção rápida e precisa de distúrbios genéticos associados a anormalidades no número de cópias e pode melhorar significativamente o diagnóstico e tratamento genético clínico.

a Principal

As aberrações cromossômicas freqüentemente estão por trás de múltiplas síndromes de anomalia que incluem características dismórficas, dificuldade de aprendizado e atraso no crescimento e desenvolvimento (1). Técnicas citogenéticas padrão, como bandamento G e SKY (espectral cariotipagem), podem identificar grandes aberrações, incluindo deleções, duplicações, amplificações e translocações desbalanceadas, embora sua resolução limitada torne essas ferramentas pouco confiáveis ​​para a detecção de alterações no número de cópias de menos de 5 Mb ( 2). FISH tem a vantagem de alta resolução, mas é mais adequado para a confirmação de síndromes conhecidas de microdeleção e microduplicação em pacientes que apresentam um fenótipo sugestivo devido ao número limitado de locos cromossômicos que podem ser analisados ​​simultaneamente.

O Array-CGH é uma tecnologia inovadora de alta resolução que detecta e mapeia alterações no número de cópias do DNA submicroscópico (3, 4), melhorando a taxa de detecção de diagnósticos de mudanças sutis no número de cópias. O Array-CGH detecta aberrações quantitativas abrangendo pequenas regiões do genoma, com resolução determinada tanto pelo tamanho quanto pelo espaçamento dos clones no array. Os arranjos de CGH identificaram com sucesso rearranjos cromossômicos desequilibrados submicroscópicos em múltiplas amostras clínicas. Em três estudos prévios de pacientes com retardo mental e dismorfismos que apresentavam cariótipos normais em análises citogenéticas padrão, os arranjos genômicos relataram taxas de detecção de rearranjo de 15%, 24% e 10%, respectivamente (1, 2, 5). Assim, uma frequência ainda maior de rearranjos é esperada em toda a população de pacientes com retardo mental e dismorfismos. Aplicações bem-sucedidas também incluem matrizes que se concentram em regiões específicas do genoma, incluindo toda a região (6–8) e parte do (9) cromossomo 22, bem como o cromossomo 1 (10) e o cromossomo X (11), e em determinados regiões conhecidas por estarem associadas a distúrbios genéticos e regiões subteloméricas (12, 13).

Rearranjos subteloméricos crípticos são responsáveis ​​por aproximadamente 5% de retardo mental inexplicável e / ou múltiplas anomalias congênitas (14). Veltman et al. (15) foram os primeiros a aplicar com sucesso um CGH-array específico de telômeros, para confirmar desequilíbrios subteloméricos conhecidos e para detectar novos rearranjos adicionais em pacientes com anormalidades citogenéticas conhecidas envolvendo um ou mais telômeros. Matrizes adicionais específicas do telômero ou do genoma completo contendo um conjunto validado de sondas de subtelômeros específicos do cromossomo humano foram, desde então, desenvolvidas e aplicadas com sucesso (12, 13, 16).

Aqui relatamos a implementação do GenoSensor Array 300 Chip, contendo 287 clones alvo de DNA representando regiões de genes específicos associados a distúrbios genéticos e regiões subteloméricas, para a identificação de novas e conhecidas alterações submicroscópicas em oito crianças com deficiência mental, anomalias congênitas, e características dismórficas.

MÉTODOS

Pacientes e análise cromossômica.

Todos os casos foram encaminhados para consulta ao Instituto Genético, Centro Médico Tel Aviv Sourasky e são apresentados na Tabela 1. Os consentimentos informados dos pacientes foram obtidos.

Tabela de tamanho completo

A análise cromossômica inicial dos leucócitos do sangue periférico foi realizada por padrão de coloração da banda G de cromossomos em metáfase. A análise citogenética foi feita de acordo com uma técnica padrão. Os cariótipos foram estabelecidos de acordo com o Sistema Internacional para a Nomenclatura Citogenética de 1995 (17).

Análise FISH.

As sondas comercialmente disponíveis foram utilizadas para análises FISH das regiões teloméricas nos cromossomas 1q, 2q e 12q (TelVysion, Abbot Vysis, Chicago, IL), 10q (QBiogene, Illkirch Cedex, França) e 14q (Cytocell, Windsor, CT). Sondas comercialmente disponíveis (LSID15S11, SNRPN, GABRB3 e LSID15S10 / UBE3A ) para a região PWS em 15q11.2-q13, TUPLE1 e N25 para a região VCF / DiGeorge em 22q11.2 (Cytocell e Abbot Vysis, respectivamente), e LSILIS1 para A região de Miller-Dieker / Lissencephaly (Abbot Vysis) também foi usada para análises de FISH. Os seguintes clones de BAC (cromossoma artificial bacteriano) que contêm sequências de genes específicos foram utilizados como moldes para a síntese de sondas de FISH (Tabela 2): RPCI11-894C9 para RASSF1 (3q21.3) (M. Rocchi, Universidade de Bari, Bari, Itália), RPCI1-74J1 para WT1 e RPCI11-307I15 para PAX6 (ambos em 11p13) (CHORI BACPAC Resources, Oakland, Califórnia). O cosmídeo 1p3 para o gene FLI1 em 11q24 (18) foi fornecido pelo Dr. Shai Izraeli, e a análise FISH para os genes WT1 e PAX6 (19) foi realizada usando os cosmídeos B2.1 e AN2, respectivamente (Dr. Karen Gronskov, pessoal comunicação).

Tabela de tamanho completo

O DNA de BAC ou cosmídeo foi extraído usando protocolos padrão. As sondas de ADN foram directamente marcadas por tradução por corte com nucleótido fluorescente Spectrum Orange (Abbot Vysis) e coprecipitadas na presença de Cot-1 (Abbot Vysis) e ADN de esperma de salmão (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Rehovot, Israel). A preparação do cromossoma e as sondas fluorescentes foram desnaturadas separadamente a 73 ° C e as sondas foram deixadas em pré -nascimento a 37 ° C antes da hibridização durante a noite. Após lavagens pós-hibridização, os cromossomas foram contra-corados com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Sinais de hibridização foram detectados usando filtros de rodamina e DAPI em um microscópio Olympus B52, e as imagens foram capturadas usando uma câmera CCD e Cytovision Software (Applied Imaging, Santa Clara, CA). Para o gene RASSF1 (3q21.3), além da hibridização FISH com todo o BAC como sonda, três fragmentos genômicos específicos de cerca de 6 Kb cada, representando as regiões 5 ', 3' e 3 'do gene, foram preparados por reação em cadeia da polimerase (PCR), reunidos e rotulados para FISH como descrito. Os iniciadores para as sondas específicas RASSF1 FISH e as condições de PCR estão disponíveis mediante solicitação.

Array-CGH.

O ADN genómico de elevado peso molecular foi extraído dos leucócitos do sangue periférico do doente utilizando o estojo de isolamento PureGene DNA (Gentra Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. A detecção do número de cópias do gene foi realizada por CGH-array utilizando o sistema Abbot Vysis GenoSensor (Abbot Vysis) de acordo com as instruções do fabricante (Abbot Vysis). Resumidamente, 100 ng de cada DNA de teste e DNA de referência normal (de um indivíduo do sexo oposto da amostra de teste) foram marcados por Random Priming Kit (Abbot Vysis) para incorporar fluoróforos Cy3 ou Cy5 (Perkin-Elmer, Boston, MA) . O ADN foi desnaturado a 100 ° C durante 10 min e foi arrefecido a 4 ° C antes da adição de fragmentos de Klenow e mistura de nucleótidos. Após incubação a 37 ° C durante 2 h, as amostras foram digeridas usando uma diluição de DNAse 1:20 durante 1 h a 15 ° C. Os nucleótidos não incorporados foram então removidos utilizando colunas de centrifugação Sephadex G-50 (Amersham-Biosciences, Piscataway, NJ). As sondas foram precipitadas com etanol e ressuspensas em Tris 10 mmol / L, pH 8, 0. Aluotas iguais de teste marcado e DNA de refercia foram combinadas num tubo com tamp de hibridao, desnaturadas a 80 durante 10 min e incubadas durante 1 h a 37 para permitir o bloqueio de sequcias repetitivas. As soluções foram então hibridizadas por 72 horas a 37 ° C com um GenoSensor Array 300. Este array contém 287 clones genômicos, incluindo aqueles para cada telômero humano, bem como todas as síndromes de microdeleção conhecidas e loci adicionais selecionados representando cada braço do cromossomo. A lista de clones do GenoSensor CGH Array 300 está disponível em //www.vysis.com/PDF/GenoSensor300ClonesAndKey_July2004.pdf. Após a hibridação, as matrizes foram lavadas em formamida a 50% / SSC 2x a 40 ° C e 1 x SSC a 25 ° C e foram contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Imagens de sinal de hibridação em três cores (Cy3, Cy5 e DAPI azul) foram então analisadas pelo sistema de leitor GenoSensor com base na coloração DAPI que identificou os pontos alvo e sua localização na grade. Analisando o conjunto de razões Cy3 / Cy5 (relações teste-referência) em todos os alvos, o software GenoSensor Array 300 Reader (versão 1) calcula a proporção mais representativa do número de cópias de DNA modal do DNA da amostra. Para cada alvo, a razão normalizada, relativa ao número da cópia do DNA modal, é calculada. Essa proporção normalizada do alvo indica o grau de ganho ou perda do número de cópias e, para cada clone, as alterações no número de cópias são apresentadas. Para cada alvo, um valor p é calculado automaticamente pelo software GenoSensor Array 300 Reader (Abbot Vysis), e um valor de p < 0, 005 foi considerado significativo.

RESULTADOS

Foram selecionados oito pacientes com deficiência mental, anomalias congênitas múltiplas e características dismórficas para desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos usando CGH-array. Todos os casos foram analisados ​​previamente por técnicas citogenéticas de rotina e as aberrações cromossômicas foram identificadas em três. Os resultados da CGH foram comparados com as análises anteriores de bandas G e FISH para verificar se as matrizes CGH poderiam verificar anormalidades previamente detectadas. Nos cinco casos restantes, o CGH-array foi implementado na tentativa de identificar potenciais rearranjos submicroscópicos em pacientes complexos não diagnosticados. Cada análise foi realizada uma vez por um operador sem conhecimento do diagnóstico anterior. Metas com razão média teste-referência> 1, 2 foram consideradas sugestivas de ganhos, enquanto aquelas com razões <0, 8 foram consideradas sugestivas de perdas, de acordo com as recomendações do fabricante (Abbot Vysis) e conforme descrito anteriormente (12, 19-21). Também realizamos quatro experimentos de controle "normais versus normais" e confirmamos esses valores de limiar. Nossa análise das amostras de controle normais resultou em um desvio padrão (SD) de 0, 05, sugerindo que 4 SDs determinam o limiar de ganhos ou perdas. A análise de potência, assumindo um DP de 0, 05 entre as amostras e uma diferença média de 0, 2 entre os controles normais e os pacientes foi de 0, 996 quando n = 4 em cada grupo (Power e Precision Software, Biostat, Englewood, NJ). Ganhos e / ou perda de material cromossômico foram detectados em seis dos oito pacientes testados (Tabela 2).

Experimentos de validação.

Em dois dos três pacientes previamente diagnosticados (casos 1 e 2), o array-CGH validou os resultados das bandagens FISH e G. No caso 1, verificamos desequilíbrio t (2; 12) (q37; q24) com trissomia 12q37-> qter e monossomia de 2q24-> qter. No caso 2, validamos a trissomia de 1qtel e o gene AKT adjacente (em 1q44) e a deleção de 11qtel. Este último é compatível com a translocação balanceada t (1; 11) (q42; q23) detectada nesta família.

A análise de FISH do caso 3 usando sondas de cosmídeos detectou a deleção de uma cópia dos genes PAX6 e WT1 localizados no cromossomo 11p13 (22). O gene PAX6 não está presente no Array 300, mas uma relação T / R de 0, 81 e um valor p significativo de 0, 002 foram observados para o WT1 na análise Array 300 deste caso (Fig. 1 A ). Embora algumas outras sondas tenham chegado perto de uma relação de T / R de 0, 8 (0, 81-0, 83), nenhuma delas, exceto a sonda WT1 no caso 3, teve um valor p significativo. Portanto, essa meta foi designada como um falso negativo limítrofe. Análises FISH repetidas do caso 3 com sondas BAC para os genes PAX6 e WT1 validaram a deleção de uma cópia do gene PAX6, mas detectaram duas cópias do gene WT1 (Fig. 1 B e C, respectivamente), sugerindo que as diferenças nas sondas 'tamanhos (BAC versus cosmidio) determinam se a deleção pode ser inequivocamente detectada.

Análises de Microarray e FISH do caso 3. ( A ) O perfil do array-CGH. Os alvos WT1 são marcados em um quadro amarelo. Como a relação T / R é 0, 81, o sinal é cinza e não aparece como uma exclusão. O ADN de teste macho foi hibridado contra o ADN de referência fêmea, resultando em sinais de deleção de alvos do cromossoma X ( vermelho ) e sinais de amplificação de alvos do cromossoma Y ( verde ). ( B ) Anise de FISH utilizando o clone BAC PAX6 RPCI11-307I15 como sonda. A seta vermelha indica a exclusão. ( C ) Análise de FISH utilizando o clone BAC WT1 RPCI1-74J1 como sonda.

Imagem em tamanho real

Detecção de novas aberrações cromossômicas em pacientes complexos não diagnosticados.

Os resultados do microarranjo CGH forneceram diagnósticos em dois dos cinco casos anteriormente não diagnosticados. No caso 4, a análise por CGH-array mostrou perdas de uma cópia de duas sondas na região 15q11.2-q13: SNRPN e GABRB3 . Quatro sondas alvo foram testadas na região de Prader-Willi / Angelman, D15S11 SNRPN, UBE3A e GABRB3, do centrômero ao telômero, usando sondas FISH e o Array 300. As sondas localizadas em ambas as extremidades desta região, GABRB3 e D15S11, demonstraram uma e duas cópias desses genes, respectivamente, usando ambos os métodos. Com as duas outras sondas, houve uma discrepância entre os resultados do FISH e do Array 300. A supressão de uma cópia de UBE3A foi observada na análise de FISH, mas não na CGH-array. Em contraste, a deleção de uma cópia SNRPN foi detectada na análise Array 300, enquanto a análise FISH demonstrou duas cópias, embora um sinal tenha sido fraco, sugerindo que um dos pontos de quebra possa ter ocorrido dentro da região do gene SNRPN . Como a hipopigmentação foi encontrada nesse paciente, sugerimos ainda que o segundo ponto de interrupção da deleção esteja localizado distalmente ao locus P. A microdeleção adicional de um dos clones subteloméricos no 14qtel não foi validada pela análise de FISH.

O caso 5 demonstrou microdeleção contígua de três genes na região 22q11.2: GSCL, HIRA e TBX1 . A microdeleção adicional de um dos clones subteloméricos no 10qtel não foi detectada pela análise de FISH.

No caso 6, as hibridizações FISH utilizando sondas de ambos os BAC e sequências específicas deste gene não confirmaram a deleção de RASSF1 em 3q21.3 detectada pelo Array 300, e por isso foi considerado falso positivo.

Finalmente, nenhuma anormalidade foi detectada nas análises de CGH-array dos casos 7 e 8.

DISCUSSÃO

Utilizamos o array-CGH como uma ferramenta adicional para resolver casos complexos não diagnosticados de crianças com deficiência mental, múltiplas malformações e características dismórficas. O chip GenoSensor Array 300, contendo 287 sondas diferentes representando regiões significativas em citogenética ou oncologia, identificou com sucesso ganhos e / ou perdas de cópias de DNA em cinco dos oito casos examinados.

Os resultados de nossas análises de array-CGH dos casos 1 e 2 correlacionaram-se bem com os rearranjos previamente detectados pelo FISH. A análise por CGH-array também detectou alterações cromossômicas em dois casos previamente não diagnosticados (casos 4 e 5). A microdeleção na região do cromossomo 15q11-q12 foi detectada no caso 4, confirmando o diagnóstico clínico suspeito da síndrome de Prader-Willi no recém-nascido. As discrepâncias entre os resultados do Array 300 e a análise comercial da sonda FISH enfatizam a importância de sondas FISH específicas para a validação de dados de microarray. Os dados combinados clínicos, FISH e array-CGH sugerem os pontos de corte dessa deleção, embora a montagem de matrizes com cobertura de clones de alta densidade em toda a região permita uma definição adicional da aberração, como mostrado anteriormente para o cromossomo 22 (6–8), o cromossomo 1p36 (10) e a região da síndrome de Prader-Willi (23), fornecendo informações mais precisas sobre os pontos de corte genômicos, o tamanho das deleções e os genes envolvidos.

O fenótipo complexo observado no caso 5 não foi específico e, portanto, não foi sugestivo de uma síndrome de microdeleção específica, tornando o diagnóstico pela citogenética clássica particularmente desafiador. Array-CGH detectou uma microdeleção na região 22q11.2, que subjaz ao espectro de DiGeorge / velocardiofacial. No entanto, vale a pena notar que a presença de uma deleção por si só não significa necessariamente que a deleção cause um fenótipo observado. As características clínicas do caso 5 (Tabela 1), juntamente com as deleções detectadas dos genes GSCL, HIRA e TBX1, sugerem que uma deleção maior envolvendo genes adicionais pode estar envolvida, afetando a extensão do fenótipo e da doença. Assim, as aplicações clínicas da CGH-array irão classificar melhor as correlações genótipo-fenótipo.

A utilização de clones genómicos de inserção grandes, tais como BACs para CGH-array, proporciona intensidade de sinal suficiente para detectar quantitativamente alterações de número de cópias únicas, assim como deleções homozigóticas e amplificações de alto nível. Vantagens adicionais de sondas de alvo maiores s� a menor quantidade de DNA gen�ico necess�ia, menor do que a quantidade necess�ia para plataformas de array de inser�o (cosm�eos ou oligonucle�idos) mais pequenas. Grandes inserções podem localizar os limites de aberração dentro do BAC, mas quando uma exclusão abrange apenas uma pequena região do BAC, resultados enganosos podem ser obtidos. Isso está bem demonstrado no caso 3. O perfil de array-CGH deste paciente não confirmou o achado citogenético prévio de uma deleção de uma cópia do gene WT1 . A relação T / R do gene WT1 foi de 0, 81, dentro do limiar normal, mas curiosamente teve um valor p significativo de 0, 002, implicando uma deleção. Essa discrepância é provavelmente devida a diferenças entre o tamanho da deleção genômica e a sonda. A primeira análise de FISH foi realizada usando uma sonda de cosmídeo, enquanto a segunda análise seguindo a matriz CGH usou um clone BAC maior. Presumindo que somente parte do gene seja deletada, uma sonda mais curta compatível com a região de deleção demonstraria a deleção, enquanto um clone maior compatível com toda a região genômica identifica o gene residual e, portanto, sugere apenas uma deleção parcial. Assim, nossos dados sugerem que o grande tamanho da sonda BAC pode ter sido a fonte do falso negativo observado aqui, e como a quantidade de DNA alvo geralmente não é limitante, o uso de sondas grandes poderia ser uma desvantagem significativa em qualquer array CGH Plataforma baseada em

Além das verdadeiras aberrações identificadas, três deleções que foram sugeridas pelo CGH-array (14qtel no caso 4, 10qtel no caso 5 e 3q21.3 no caso 6) não foram confirmadas pela análise de FISH (Tabela 2). Nos casos 4 e 5, apenas um dos dois clones localizados na região subtelomérica foi alterado, enquanto o segundo clone subtelomérico foi normal, sugerindo que ambos os casos representam um polimorfismo em vez de uma verdadeira deleção. Esses achados são consistentes com duas triagens genômicas recentes que relatam polimorfismos de larga escala na população geral (24, 25). Além disso, alterações no número de cópias no 10qtel foram detectadas recentemente em amostras normais (12), sugerindo um polimorfismo de comprimento de seqüência de DNA neste local. A terceira deleção que não foi confirmada por FISH (caso 6) envolveu o gene RASSF1 em 3q21.3 que foi representado como um único alvo no array. A análise repetida deste caso em uma segunda matriz demonstrou duas cópias do gene RASSF1 (relação T / R de 0, 83), validando ainda mais este resultado como um falso positivo. Nossos resultados sugerem que uma análise replicada é recomendada para amostras clínicas, mas alternativas, como repetir apenas as matrizes questionáveis, como sugerido por Schaeffer et al. (19), ou confirmação por um segundo método, como FISH, também é possível. Nossos dados, incluindo estes três clones não confirmados juntamente com o equívoco gene WT1, sugerem uma taxa presumida de falso-positivo de 0, 2%, não substancialmente diferente de taxas de falso-positivos relatados anteriormente de 0, 4% (15, 26) e 0, 9% (13) . No entanto, tendo em conta que este estudo foi feito em uma população de alto risco, também é importante considerar a taxa de falso-positivos quando o número de pacientes estudados é usado como denominador. Dos cinco pacientes com deleções, um era falso positivo, resultando em uma taxa de falso-positivo relativamente alta por paciente de 20%. Embora a taxa de falso-positivo real por paciente não possa ser deduzida do nosso tamanho de amostra limitado, a taxa de falso-positivo por paciente deve ser levada em consideração ao considerar qualquer CGH de matriz como uma ferramenta de diagnóstico clínico.

Em resumo, usando o microarray Array 300, identificamos microdeleções e aberrações subteloméricas em recém-nascidos e crianças com atraso no desenvolvimento e múltiplas anomalias congênitas. O Array-CGH oferece uma rápida análise genômica em alta resolução e fornece informações diretamente ligadas aos mapas físicos e genéticos do genoma humano. Embora esse ensaio de alta resolução avance na identificação de aberrações genômicas ocultas subjacentes às síndromes de retardo mental humano e malformação, pode levar algum tempo para a evolução de uma plataforma avançada, combinando alta precisão, precisão e especificidade com o mínimo de falsos positivos e falsos negativos. juntamente com alta resolução e custos mais baixos.

Os dados discutidos nesta publicação foram depositados no Gene Expression Omnibus da NCBI (GEO; //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) e podem ser acessados ​​através do número de acesso da GEO Series GSE4775.

Agradecimentos

Agradecemos à Abbott Vysis, Inc. pelos reagentes utilizados neste estudo e à Dra. Karen Gronskov pela análise de FISH com sondas cosmídicas para o paciente 3.